Durante la época colonial la Iglesia Mayor, como se la conocía en ese entonces, fue el principal centro del culto religioso por ser la “parroquia de españoles”. Las piedras labradas traídas de las ruinas del Tomebamba, sirvieron para sus cimientos y bases de los muros. 

La Iglesia Mayor llega a ser catedral con el obispado a fines del siglo XVIII. En la actualidad la iglesia mantiene su estructura básica colonial a pesar de varias remodelaciones realizadas en los siglos XIX y XX. Este edificio dejó su función religiosa para dar lugar a lo que hoy conocemos como el “Museo Catedral Vieja” el cual mantiene invaluables obras de arte inherentes a esta edificación, como son el púlpito tallado por Gaspar Sangurima, el conjunto escultórico de la Última Cena del escultor Daniel Alvarado, el órgano tubular construido en 1739 por Antonio Esteban Cardoso, las pinturas murales de Nicolás Vivar, etc.

De acuerdo a ciertos autores se piensa que a inicios de la colonia debió existir en el lugar en donde hoy se erige la Catedral Vieja, una ermita de dimensiones muy modestas. La construcción de la Iglesia Mayor para la parroquia de españoles, empieza en el año de 1568. Se hicieron varias re-estructuraciones de este edificio, siendo la tercera y más importante en 1617. Para ese entonces la capilla mayor o presbiterio con su altar y su retablo grande estaba construida de adobes. La capilla mayor se integraba a la nave central por el arco toral construido de ladrillos. El cuerpo

de la iglesia se conformó por tres naves, teniendo la nave oriental cuatro capillas laterales: la capilla de los Avedaños, la capilla de Guillermo Hernández, la capilla de los Coroneles y la capilla del bautisterio y su pileta.

Por motivos socio-religiosos de la época, los pisos de la Iglesia Mayor se vendieron para el enterramiento o sepultura de los estratos acomodados de la sociedad. El Museo Catedral Vieja conserva el testimonio arquitectónico de estas sepulturas o “catacumbas”.

Cabe mencionar como dato importante, que la Misión Geodésica Francesa a su llegada a Cuenca en el año de 1739, tomó la torre sur de esta iglesia como punto referencial para las triangulaciones que servirían para la medición de un arco de meridiano terrestre. Es por ello que podemos ver en esta torre una placa que conmemora este hecho con la leyenda “Torre más célebre que las Pirámides de Egipto”